Quattro metodi per controllare il pH nei bioreattori

Mantenere il pH a livelli biologicamente sani è potenzialmente lo strumento più potente nel bioprocesso upstream per aumentare i titoli di prodotto.

Mantenere il pH a livelli biologicamente sani è potenzialmente lo strumento più potente nel bioprocesso upstream per aumentare i titoli di prodotto. Le bioreazioni sono costose e hanno tempi lunghi, il che rende fondamentale massimizzare ogni ciclo.

Le cellule di mammifero sono vitali solo in ambienti con pH compreso tra 7,1 e 7,4. Ma le cellule producono naturalmente anidride carbonica come sottoprodotto della respirazione, il che fa scendere il pH. Le cellule dispongono naturalmente di meccanismi per eliminare l’anidride carbonica e prevenire accumuli tossici, e di sistemi tampone per mantenere il proprio pH a livelli sani. I bioreattori devono imitare queste caratteristiche per garantire che le cellule possano prosperare.

Che cosa influenza il pH della coltura?

All’inizio di un ciclo del bioreattore, il tampone presente nel terreno di coltura mantiene il pH ai livelli desiderati. L’anidride carbonica può anche essere immessa tramite sparging per mantenere basso il pH. Ma durante la fase di crescita esponenziale della coltura, le cellule generano grandi quantità di anidride carbonica come prodotto di scarto metabolico. Il tampone cede e il pH scende rapidamente.

A quel punto, il pH della coltura deve essere aumentato. Storicamente, si pompava una base nel terreno di coltura. Oggi, le configurazioni di bioreattore più recenti utilizzano macrosparger per introdurre grandi bolle di aria o di azoto. Queste bolle non si dissolvono facilmente, quindi strippano l’anidride carbonica dalla coltura, portandola nello spazio di testa del bioreattore, da cui viene rimossa.

La letteratura recente ha esaminato attentamente i mezzi più efficaci per controllare il pH in un bioreattore. Qui classifichiamo quattro approcci al controllo del pH, dal meno al più efficace.

Il meno efficace: mantenere costante la pCO2

La pressione parziale dell’anidride carbonica disciolta (pCO2) in una coltura è un parametro di processo critico per il suo effetto sul pH intra- ed extracellulare. La pCO2 determina il gradiente di concentrazione attraverso il quale l’anidride carbonica intracellulare (generata come sottoprodotto della crescita cellulare) esce dalle cellule ed entra nel terreno di coltura. Se la pCO2 è troppo alta, la CO2 non può uscire dalle cellule, quindi il pH intracellulare scenderà e le cellule moriranno. Se la pCO2 è troppo bassa, le cellule perdono la CO2 troppo rapidamente, il loro pH salirà e l’ambiente intracellulare diventerà troppo basico perché le cellule siano vitali.

La pCO2 influisce sul pH, ma non sono strettamente correlati

In particolare all’interno dell’intervallo di pH tamponato, pCO2 e pH non sono direttamente correlati. La pCO2 fornisce quindi molte meno informazioni sullo stato di salute della coltura rispetto alla misura del pH.

Il motivo principale è che, con piccole variazioni del pH all’interno del campo di vitalità cellulare (pH 7,1 – 7,4), il tampone bicarbonato nel terreno (extracellulare) influirà sulla pCO2 secondo il principio di Le Chatelier.

Inoltre, le cellule di mammifero generano lattato, oltre all’anidride carbonica, come sottoprodotto della respirazione. Lattato e CO2 rendono entrambi la coltura più acida, ma l’effetto del lattato sul pH non si riflette nella misura della pCO2.

Dopo che il tampone cede e il pH inizia a calare in modo significativo, pCO2 e pH sono molto più strettamente correlati. Ma non è comunque un mezzo valido per monitorare e controllare il pH — che è la variabile che conta davvero per aumentare i titoli cellulari.

Meno efficace: pompare una base nella coltura

Le cellule producono grandi quantità di anidride carbonica durante la fase di crescita esponenziale, con conseguenti cali significativi del pH. Una soluzione semplice è pompare una base nel bioreattore utilizzando la retroazione diretta dei sensori di pH.

Questo metodo è più efficace in:

- Bioreattori più piccoli, in cui gli effetti di una miscelazione non uniforme e della localizzazione del pH possono essere trascurabili.

- Ambienti con bassa pCO2 e basso pH, in cui le cellule generano CO2che si dissolve rapidamente, abbassa ulteriormente il pH e non può essere rimossa con i gas di sparging.

- Fermentatori fermentatori che coltivano cellule microbiche, che sono più robuste delle cellule di mammifero. Possono sopportare sia una maggiore agitazione e miscelazione, sia essere meno sensibili alle fluttuazioni del pH.

Pompare una base non garantisce un pH costante in tutto il bioreattore

Per ottenere un titolo di prodotto elevato, il pH deve essere costante in tutto il bioreattore, il che richiede una miscelazione accurata. In caso contrario si formeranno sacche localizzate di pH particolarmente alto o basso. Ma la miscelazione genera schiuma e aumenta la sollecitazione di taglio, due fattori che danneggiano la vitalità cellulare.

Questi problemi si aggravano al crescere delle dimensioni del bioreattore, il che significa che pompare una base semplicemente non scala bene. Il tempo di miscelazione e l’agitazione devono entrambi aumentare con le dimensioni del bioreattore per evitare di peggiorare la localizzazione, ma ciò avviene a spese di una maggiore schiuma e sollecitazione di taglio.

Pompare una base aumenta inoltre l’osmolalità (soluto per chilogrammo di terreno di coltura) della coltura. Nei bioreattori più grandi, questo può ridurre la vitalità cellulare e il titolo di prodotto.

Più efficace: combinare il pompaggio di una base e i gas di sparging

Il metodo tradizionale di controllo del pH consiste nel pompare una base in un bioreattore nelle prime fasi di una coltura cellulare e poi usare i gas di sparging durante la fase di crescita esponenziale. La base è particolarmente utile subito dopo che il tampone cede, e i gas di sparging offrono un controllo stretto, per ottenere le rese massime da una coltura.

Pompare una base ha notevoli svantaggi, e i gas di sparging hanno notevoli vantaggi

Le configurazioni più aggiornate utilizzano principalmente i gas di sparging per controllare il pH. La letteratura recente si è allontanata dagli altri metodi per concentrarsi sull’ottimizzazione dell’anello di controllo dei gas di sparging utilizzando la retroazione del pH e di altri parametri critici di processo — compresa la pCO2.

Il più efficace: usare solo i gas di sparging

I gas di sparging possono controllare il pH in modo più stretto degli altri metodi discussi, principalmente perché possono reagire più rapidamente alle variazioni di altri parametri critici di processo. La miscela dei gas di sparging offre anche il controllo più preciso e la capacità di rispondere alla maggiore quantità di informazioni proveniente dai vari sensori del bioreattore.

In particolare, diversi fattori rendono questo metodo il più efficace:

- Le portate di sparging sono limitate solo dalle portate massime dei regolatori di portata massica che alimentano i gas agli sparger. Gli specifici micro- e macrosparger possono essere progettati e scalati in base alle portate desiderate e ai principi noti del trasferimento di massa.

- Le bolle di gas degli sparger possono essere miscelate e distribuite in modo uniforme più rapidamente di una base, e con una agitazione molto minore.

- I gas di sparging scalano molto bene, perché la portata di sparging e la dimensione delle bolle spesso non devono cambiare al crescere del bioreattore. Uno studio del 2018 di Hoshan et al. ha mantenuto costante la portata di sparging e ha semplicemente aumentato l’aerazione dello spazio di testa per compensare l’aumento delle dimensioni del bioreattore. Hanno visto titoli aumentare di quantità simili sia in bioreattori da 30 L sia da 250 L semplicemente predisponendo anelli di controllo più ottimizzati tra il pH e l’aria immessa con lo sparging.

La progettazione intelligente degli sparger e dell’anello di controllo è fondamentale

Se i gas fluiscono troppo rapidamente, introducono sollecitazione di taglio. Se i gas fluiscono troppo lentamente, le cellule non si riprodurranno con la rapidità con cui potrebbero altrimenti, e non raggiungeranno la resa massima.

Sparger ben progettati, al contrario, scaleranno bene e produrranno costantemente titoli elevati.

Per saperne di più: confronto tra bioreattori a serbatoio agitato, orbitali e oscillanti $