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Studio della coltura cellulare dell'insetto - nota di applicazione degli strumenti di MCQ

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Atmosfera modificata: miglioramento della sperimentazione delle colture cellulari dell'insetto.

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I vaccini, gli antibiotici ed altre medicine essenziali hanno costituito sempre le necessità di base per la nostra società. Il bisogno di queste merci, notevolmente aumentato durante gli ultimi parecchi decenni, conduce la scienza moderna verso i nuovi metodi di produzione affidabili ed efficienti della droga. La produzione su grande scala delle medicine di base conta sulla capacità di sintetizzare gli importi adeguati delle proteine specifiche, espressi naturalmente nella loro forma del tipo selvatico o appropriato modificati. Una delle tecniche più ampiamente usate destinate per migliorare la produzione della proteina, è l'espressione eterologa della proteina (HPE). La tecnica di HPE è bassa per seguenti principi:

• Il tipo delle cellule che esprime naturalmente la proteina bersaglio è selezionato.

• Il materiale genetico richiesto per esprimere la proteina bersaglio è raccolto dalla cellula.

• Il materiale genetico è trasferito sperimentalmente in un altro tipo delle cellule che non esprime normalmente quella proteina.

• Il tipo delle cellule con i nuovi progressi materiali di materiale genetico inseriti la capacità di esprimere la proteina bersaglio.

I due tipi delle cellule derivano solitamente dagli organismi differenti, così dal termine eterologo. L'espressione delle proteine funzionali in ospiti eterologi è attualmente una pietra angolare di biotecnologia moderna. Oltre alle applicazioni commerciali su grande scala, queste tecniche è uno strumento incredibilmente utile per ricerca di base del laboratorio, così richiedendo i miglioramenti costanti nella velocità, nei costi e nell'efficacia. Un punto chiave della produzione delle proteine è la coltura cellulare, durante cui l'atmosfera del sistema svolge un ruolo cruciale. Per questo motivo, il MCQ propone le sue serie del miscelatore del gas come strumento fondamentale per controllare, studiare e migliorare l'espressione della cultura.

Sistema di vettore di espressione di baculovirus.

Il HPE moderno sfrutta molti tipi di ospiti eterologi. I sistemi di espressione più ampiamente usati sono basati su Escherichia coli come la cellula ospite. Yeats, le muffe ed i funghi (cioè funghi) sono un'altra classe importante di ospiti (più informazione dettagliata circa le culture dei funghi può essere trovata qui [collegamento]). Un approccio relativamente nuovo e di promessa al sistema di espressione invece è basato sugli ospiti delle cellule dell'insetto. Come i batteri ed i funghi, la capacità di espressione delle cellule dell'insetto è modificata artificialmente per permettere che la cultura produca le proteine specifiche. Il processo di modifica ha luogo via il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS). I punti importanti di tecnica di BEVS possono essere riassunti come per seguire:

• La piccola parte della codifica del filamento del DNA (il gene) le informazioni richieste per esprimere la proteina bersaglio è trasferita nel genoma di baculovirus via un vettore di trasferimento. Il vettore di trasferimento sostituisce un gene non indispensabile di baculovirus con il gene estraneo, lasciando le capacità della riproduzione e di infezione del virus identicamente.

• Il baculovirus risultante (chiamato ricombinante) è usato per infettare le colture cellulari dell'insetto. Il nuovo materiale genetico è trasferito nelle cellule ospiti e dopo poche ore la cultura comincia esprimere la proteina desiderata.

CARATTERISTICHE DI BEVS

• Vantaggi

BEVS è ampiamente usato nella ricerca e nelle comunità industriali scientifiche per la produzione delle proteine di alta qualità, la maggior parte di loro provenute dalle cellule di mammiferi che sono inadatte alle culture del laboratorio. Questa tecnica offre molti vantaggi sopra gli altri sistemi culturali, compreso i tassi di produzione aumentati, i più grandi rendimenti, i prodotti con la solubilità migliore e la capacità sintetizzare le proteine con le modifiche di posttranslational (spesso identiche a quelle che si presentano in cellule di mammiferi). La natura del baculovirus stessa costituisce un grande vantaggio per i ricercatori. La famiglia di Baculoviridae è uno dei gruppi più più conosciuti di virus, capaci di infezione oltre 500 specie di cellule dell'insetto e più recentemente, anche poche delle linee cellulari mammifere. La procedura standard di BEVS usa un baculovirus specifico, ha chiamato il virus della poliedrosi nucleare di autographa californica (AcNPV), particolarmente adatto a sua gamma stretta ospite. Il AcNPV è conosciuto per infettare soltanto poche famiglie del lepidottero (lepidottero) e si è rivelato essere non contagioso per le linee cellulari mammifere. L'uso di questo baculovirus specifico quindi non solo in altamente selettivo per le linee cellulari dell'insetto ma anche sicuro per gli esseri umani.

• Svantaggi

Malgrado questi vantaggi potenziali, BEVS soffre alcuni degli svantaggi peculiari compartecipi da tutto il sistema eterologo di espressione. Le differenze in proteine espresse dalle cellule mammifere e baculovirus-infettate dell'insetto sono state descritte ed in alcuni casi, sormontato. Le edizioni relative al ciclo di infezione possono colpire la piegatura di proteine, finalmente conducente alla formazione di aggregati indesiderati. Il tasso di espressione per determinate proteine può essere considerato insufficiente e una certa modifica di posttranslational può accadere incontrollabile o non può accadere affatto.

CELLULA CUTURE DELL'INSETTO

L'asse ha detto prima, BEVS comprende l'uso di un virus specifico, capace di infezione soltanto delle cellule del lepidottero. Le cellule dell'insetto più ampiamente usate sono le linee cellulari Sf9 e Sf21. Le entrambe linee delle cellule sono scelte importanti, ma Sf9 le cellule (che sono un sotto-clone delle cellule Sf21) sono spesso preferito dovuto il loro tasso di crescita più veloce e più alte densità delle cellule. Le cellule dell'insetto sono adatte sia a piccole che culture su grande scala. Nel caso di piccole culture, i matracci di cultura del filatore o dell'agitatore possono fornire i prodotti base adeguati ma per le più grandi produzioni, la crescita delle cellule dell'insetto deve essere effettuata in bioreattori e la cultura è controllata costantemente con attrezzatura sperimentale avanzata.

• Ossigeno disciolto

Un controllo adeguati sopra i parametri di lavoro sono cruciali per le colture cellulari. La composizione nutriente del terreno di coltura, il pH, la temperatura, l'umidità ed altri parametri tutto dell'atmosfera sono sottoposti ad un processo costante dell'ottimizzazione per migliorare i risultati della cultura. Le cellule dell'insetto si sviluppano senza difficoltà nella temperatura ambiente (optimum da 25 a 27°C) e senza alcun supplemento della CO2, ma ancora nell'atmosfera della cultura svolge un ruolo chiave nel processo di crescita, per uno dei parametri cruciali è l'ossigeno disciolto (FACCIA). L'ossigeno atmosferico tende spontaneamente a dissolversi nell'acqua fino a raggiungere un equilibrio di saturazione. Per l'acqua pura che è in contatto con un'atmosfera dell'ossigeno puro, il valore di saturazione (cioè l'importo di ossigeno disciolto) a 25°C e 1 barra è circa 8 mg/l. Poiché la relazione fra ossigeno atmosferico ed ossigeno disciolto è direttamente proporzionale, quando l'ossigeno puro è sostituito da un'atmosfera più bassa dell'ossigeno, FACCIA di conseguenza le diminuzioni. Nel caso di acqua pura che è in contatto con l'aria (21% di ossigeno) i risultati disciolti dell'ossigeno in 21% del valore di saturazione (così 21% di 8 mg/l, di circa 1,7 mg/l). L'influenza di ossigeno disciolto sulle colture cellulari dell'insetto è ben documentata nella letteratura scientifica. Molta sperimentazione usa l'aria standard come atmosfera della cultura. In alcuni casi, questa configurazione può risultare essere efficace, ma la mancanza un controllo adeguato dell'ossigeno è generalmente importuna. La quantità elevata di FA può essere o troppo, causando un'intolleranza delle cellule, o troppo basso, causante l'inedia delle cellule. Gli entrambi effetti sono nocivi al tasso di crescita delle cellule ed alla qualità di espressione della proteina. Lavorando con un sistema di controllo della composizione nell'atmosfera assegna la possibilità per intraprendere la sperimentazione avanzata, in cui le risposte della cultura a differente FANNO i valori possono essere controllate con le prove adeguate, permettendo che i ricercatori trovino lo stato ottimale della crescita per ogni coltura cellulare.

SOLUZIONE DI MCQ

Per tutte quelle applicazioni in cui un controllo fine sopra la composizione dell'atmosfera è richiesto, MCQ suggerisce l'uso della sua serie del miscelatore del gas. Le serie del miscelatore del gas sono gli strumenti ideali per i preparati dei miscugli di gas di precisione e le applicazioni dinamiche dei miscugli di gas. Le serie del miscelatore del gas sono prodotti professionali destinati per lavorare con fino a 6 miscugli di gas non aggressivi delle componenti. Lo strumento è calibrato sulla richiesta del cliente ed in caso di bisogno, è possibile da lavorare con differenti configurazioni delle regolazioni del gas con l'uso del fattore di conversione relativo ad ogni media del gas. Le caratteristiche principali di serie del miscelatore del gas sono un'alta precisione (accuratezza di 1% per ogni canale), un'alta ripetibilità (0,16% di valore della lettura) ed il tempo di reazione più veloce per i cambiamenti del punto vincente del valore disponibili sul mercato.

Impacchettato con gli strumenti il MCQ fornisce al responsabile del miscelatore del gas, un software (compatibile con qualsiasi desktop e personal computer Windows-operanti del computer portatile) che assicura un modo facile ed intuitivo dirigere dinamicamente le miscele.

• Configurazione di hardware

Un esempio della configurazione di hardware di serie del miscelatore del gas di MCQ è rappresentato nell'immagine. Lo strumento funziona con i gas asciutti e non aggressivi. Le fonti del gas possono essere sia pure o miscele (in nostri gas puri di esempio sono stati scelti per semplicità). Le bombole a gas sono collegate allo strumento attraverso i tubi da 6 millimetri del diametro e una valvola di ritenuta è installata su ogni linea come dispositivo di prevenzione di riflusso. Ogni media del gas sono collegati e controllati da un canale dedicato dei miscelatori del gas. Un altro tubo da 6 millimetri infine collega lo strumento al sistema di lavoro in cui l'esperimento ha luogo. UN PC è collegato ai miscelatori del gas attraverso una connessione USB semplice. Tutte le caratteristiche degli strumenti e le proprietà del miscuglio di gas possono poi essere dirette con il software del responsabile del miscelatore del gas.